Na leto se rodi okoli 1000 otrok z eno od redkih bolezni

Omenjeni sekvenator je, po besedah pobudnika nakupa, Tadeja Batellina, edini v regiji. “Hvala za skoraj četrtino vsega denarja ljudem. Kot veste, je k napravi prispevala Ustanova za novo pediatrično kliniko,” je ob prevzemu naprave na Pediatrični kliniki še dodal predstojnik Kliničnega oddelka za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni na omenjeni kliniki.

Pri nakupu naprave  je UKC Ljubljana združil lastna sredstva ter prispevke raziskovalnega programa ARRS Pediatrične klinike ter sofinancerjev: Javne agencije za raziskovalno dejavnost RS prek Paketa 17 za večjo raziskovalno opremo in Ustanove za pediatrično kliniko, ki je več kot leto dni zbirala prostovoljne prispevke za ta namen. Večino sredstev za napravo in potrošni material je prispeval UKCL, iz ARRS je bilo zagotovljenih okrog 240.000 tisoč evrov, Ustanova za Pediatrično kliniko pa je zbrala 127.000 evrov, so zapisali na Ustanovi za Pediatrično kliniko v Ljubljani.

Kot opisuje Jernej Kovač iz laboratorija za diagnosticiranje bolezni, je sekvenator nove ali naslednje generacije (NGS) kompleksen aparat, ki omogoča analizo oz. branje zaporedja gradnikov naše dednine. Dednina (DNK) je sestavljena iz zaporedja 4 specifičnih gradnikov – nukleotidov (adenin, gvanin, citozin in timin), ki se v ustreznem zaporedju nizajo v dolge verige DNK, ki se nahaja v jedru skoraj vsake naše celice. 

"DNK je nosilka navodil za izgradnjo ključnih celičnih gradnikov – beljakovin, saj zaporedje nukleotidov določa, kako se bo v celici izgradila molekula specifične beljakovine, ki nato sestavlja dele naših tkiv in organov ter omogoča njihovo pravilno delovanje," je razložil Kovač in pojasnil, da če pride v zaporedju nukleotidov do spontane ali pa podedovane spremembe, lahko to posledično vpliva na pravilno delovanje beljakovin, količino njihovega nastajanja ter ostale procese, kar pa lahko privede do različnih kompleksnih, redkih in tudi bolj pogostih bolezni.

"Z omenjeno napravo v izolirani DNK naših preiskovancev iščemo ravno te spremembe, ki so potencialen vzrok za izraženo bolezen otroka," je dejal. V ta namen celotno DNK razrežejo na manjše koščke, ki jih ustrezno obdelajo, ter prenesejo na aparat na t. i. pretočno celico, kjer s procesom t. i. sekvenciranja s sintezo na trdnem nosilcu "preberejo" zaporedja nukleotidov na posameznem koščku DNK. 

Sekvenciranje s sintezo na trdnem nosilcu je strokoven termin, ki pomeni, da koščke DNK z ustreznim kemijskim postopkom pritrdijo na trdno podlago/nosilec – v našem primeru je to steklo, potem pa v urejenih cikličnih korakih z dodajanjem t. i. komplementarnih nukleotidov, preberejo sekvenco/zaporedje nukleotidov na koščkih DNK, ki so jih nanesli na aparat. "Ko podatke o teh zaporedjih zberemo, se prične analiza na precej zmogljivih računalniških sistemi, s katerimi ugotovimo, na katero mesto v človeškem genomu posamezen prebrani košček DNK spada in ali se v katerem od teh koščkov nahaja kakšna sprememba, ki bi lahko vplivala na razvoj in izraženje bolezni pri našem preiskovancu," je dejal.

Katere so prednosti?

Tehnologijo NGS so na Kliničnem inštitutu za specialno laboratorijsko diagnostiko (KISLD) Pediatrične klinike UKC LJ v rutinsko uporabo uvedli že leta 2014, vendar je bil tisti aparat bistveno manj zmogljiv in je omogočal hkratne analize na le manjšem delčku celotnega človeškega dednega zapisa, pojasnjuje Kovač. "Dedni zapis človeka je relativno velik in v grobem šteje nekaj čez 3 milijarde nukleotidov," je pripomnil in dodal, da je za tiste čase pomenil astronomski preskok v genetski diagnostiki redkih bolezni pri otrocih in mladostnikih na Pediatrični kliniki. 

S sekvenatorjem so prišli do tehnoloških zmogljivosti, ki omogočajo, da lahko analiziramo praktično celoten človeški dedni zapis v eni sami analizi. "Te obsežne preiskave smo pred tem lahko izvajali le tako, da smo DNK-preiskovanca poslali v zunanje inštitucije, ki so opravile sekvenciranje, nam pa vrnile podatke, ki smo jih nato analizirali, to pa je zahtevalo pošiljanje anonimizirane DNK v tujino, ter bistveno več časa za analizo, saj smo na podatke čakali tudi po več tednov," je dejal in dodal, da so zdaj to zmogljivost pridobili neposredno v KISLD. "S čimer upamo, da bomo lahko tako kompleksne preiskave ponudili širšemu krogu preiskovancev, hkrati pa tudi računamo, da bomo postopno pomembno skrajšali čas do pravilne diagnoze za preiskovanca."

Postopek se prične s sumom s strani zdravnika

Postopek se prične s postavitvijo suma na možno genetsko bolezen s strani zdravnika specialista. Sledi natančen pregled preiskovanca in ovrednotenje njegovih kliničnih znakov, ter posvet s starši oz. skrbniki, kjer se predstavi pomen in možne posledice genetske preiskave, ter pridobi ustrezna soglasja. 

"Dober opis izraženih kliničnih znakov je pomemben, saj bistveno pripomore k uspešni genetski diagnostiki, ker nas klinični znaki lahko ustrezno usmerijo in zožijo potencialni nabor genov, ki bi lahko bili vzročni za preiskovančevo bolezen," je razložil Kovač. Sledi odvzem vzorca krvi, iz katerega se izolira preiskovančeva DNK. V primeru kompleksnih kliničnih slik pridobijo tudi vzorce DNK od staršev preiskovanca, seveda, če je to le mogoče. "To nam lahko zelo pomaga pri prepoznavanju pomembnih genetskih sprememb pri preiskovancu. Nato pripravimo vzorec DNK tako, da je primeren za analizo na sekvenatorju," je dodal. Ta postopek vključuje relativno kompleksen in dolg laboratorijski postopek med katerim DNK ustrezno razrežemo in obdelamo, da je primerna za sekvenciranje. 

Potem, ko je vzorec sekvenciran, sledi bioinformatska analiza podatkov, ki je ključna, da množico genetskih podatkov spravijo v obvladljivo obliko, ki je razumljiva genetiku, ki podatke analizira. Ta korak zahteva izredno zmogljive računalniške sisteme, pri čemer je zmogljivost računalniškega sistema izrazito povezana s časom, ki se ga porabi za ta korak – zmogljivejši sistem omogoča hitrejšo analizo podatkov in posledično krajši čas do končnega rezultata. Ko identificiramo potencialno vzročno genetsko spremembo opravijo potrditvene teste na preiskovancu in na njegovih starših in občasno tudi sorojencih. "Na ta način lahko potem predamo genetski rezultat specialistu zdravniku, kliničnemu genetiku, ki lahko potem ustrezno svetuje družini glede poteka bolezni in morebitnega zdravljenja oz. terapije, kot tudi glede morebitnega prihodnjega načrtovanja družine," je dodal.

Starejši sekvenator, ki so ga pridobili leta 2014, omogoča le analizo manjših delčkov celotne dednega zapisa, medtem ko bodo z novim sekvenatorjem lahko analizirali celoten genom preiskovanca. To poleg večjega uvida v dedno informacijo preiskovanca, omogoča tudi bistveno bolj natančne analize, kjer bodo lahko pridobili tudi informacije za morebitne kompleksnejše preureditve in spremembe v genomu, kar bo povečalo diagnostični izplen.

Nova naprava skrajšala čas do izvida

"Zaradi večje zmogljivosti pa računamo tudi, da bomo postopno pomembno skrajšali čas do izvida, kar je za družine z resno bolnimi otroki tudi izredno pomemben faktor," je zatrdil. Glede na izkušnje tujih centrov bomo lahko za okoli 2-krat povečali tudi število pozitivnih diagnoz, s tem pa bomo lahko večjemu delu bolnikov in njihovih družin podali odgovor - zakaj so bolni in kako lahko to vpliva na njihovo prihodnost.

Na leto se rodi okoli 1000 otrok z eno od redkih bolezni

Redke bolezni so izredno velika skupina različnih kompleksnih bolezenskih stanj. Trenutno je poznanih okoli 8000 redkih bolezni, ki posamezno prizadenejo manj kot enega od 2000 ljudi, vendar pa kumulativno nekje med 5 % in 7 % prebivalstva. Tako ocenjujemo, da v Sloveniji z eno od redkih bolezni živi okoli 120.000 bolnikov. Glede na statistiko tudi ocenjujemo, da se na leto rodi okoli 1000 otrok z eno od redkih bolezni, vendar se te bolezni ne izrazijo istočasno in niti ne nujno, da takoj ob rojstvu. V otroški dobi se izrazi okoli 80 % vseh redkih bolezni, velika večina med njimi pa je genetsko pogojenih. 

Za uspešno in varno uporabo aparata je treba opraviti tudi osnovno izobraževanje

Z napravo lahko rokuje le ustrezno tehnično izpopolnjen laboratorijski kader. Je pa rokovanje s sekvenatorjem le del obsežnejšega diagnostičnega procesa, ki pa poleg osnovnih laboratorijskih znanj zahteva tudi širše poznavanje humane genetike in znanje iz bioinformatske analize podatkov. 

Posledično analize na KISLD opravlja večinoma kader z VIII. stopnjo izobrazbe, prav tako pa imajo tudi specialiste laboratorijske medicinske genetike, bioinformatike, ki omogočajo pripravo in postavitev ustreznih bioinformatskih analitskih poti, ter biokemike, biologe in mikrobiologe, ki omogočajo razvoj novih postopkov priprave vzorcev DNK za kompleksnejše analize, optimizacijo procesov priprave vzorcev itd. Končni rezultat - dobro delujoč diagnostični genetski laboratorij, je posledica sodelovanja in koordinacije delovanja široke multidisciplinarne ekipe strokovnjakov.

"Za uspešno in varno uporabo aparata je vedno potrebno opraviti tudi osnovno izobraževanje iz rokovanja in ustreznih postopkov za pravilno delovanje aparata," je še pojasnil Kovač. Zaradi trenutne situacije se je izobraževanje za delo z aparatom odvijalo večinoma na daljavo, prek videokonferenc, kjer so spoznali osnove in specifike delovanja samega sekvenatorja, posebnosti priprave vzorcev za ta specifični tip sekvenatorja, ter parametre in postopke, s katerimi lahko sledijo ali je delovanje sekvenatorja pravilno in nemoteno, ter ali so podatki, ki jih pridobivajo ustrezne, kakovosti. Krajši in omejen del pa je bil prikaz in učenje neposredne uporabe sekvenatorja, ki pa je potekal neposredno ob aparatu. "Veliko pa tudi pomenijo pretekle dolgoletne izkušnje dela s tehnologijo NGS, kar je omogočilo precej hitrejše predajanje znanja s strani inštruktorjev," je še povedal.