Nikolayev se je v soboto zvečer zgrudil med sojenjem vseruskih športnih iger in kasneje v bolnišnici podlegel posledicam srčne kapi.
Nikolayev je postal tretji ruski astronavt, ki je potoval v vesolje. V sočasni misiji je skupaj s Pavlom Popovichem v drugem plovilu leta 1962 poletel v vesolje. Tako je uspela prva simultana vesoljska misija, Nikolayev pa je s tem, ko je v 96 urah kar 64-krat obkrožil Zemljo, postavil rekord v zdržljivosti človeka.
Leta 1970 se je vrnil v vesolje na svoji drugi misiji, in sicer na krovu raketoplana Soyuz 9. Vsega skupaj je v vesolju preživel več kot 200 ur.
Kar dvakrat so ga imenovali za nacionalnega heroja Sovjetske zveze, bil je ključni člen sovjetskega združenja astronavtov, katerim je pripadal tudi Yuri Gagarin, prvi človek, ki je leta 1961, poletel v vesolje. Poročen je bil z Valentino Tereshkovo, ki je leta 1963 postala prva ženska, ki je poletela v vesolje.
